人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞提取物培養(yǎng)

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人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞提取物【Human Brain Venous: Normal Cerebral Venous Vascular Smooth Muscle Cells Derivatives】

人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞提取物是從人原代腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞提取的，人原代腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞從正常人腦靜脈血管平滑肌組織制備。正常人腦靜脈血管平滑肌組織采集自各地方醫(yī)院，采集工作根據(jù)IRB 和 HIPAA批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過嚴(yán)格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆，

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。生物科技提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結(jié)果等。
cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA第一鏈，以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運(yùn)輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴(yán)格的QA/QC分析，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人關(guān)節(jié)軟骨組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細(xì)胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；
③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

實(shí)驗(yàn)事項(xiàng)：

1. 試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時(shí)，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí)，前一個(gè)孔與后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育"時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時(shí)，一次不要小于10μl)，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7.  底物：底物請避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
    建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
    如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請后乘以稀釋倍數(shù)。

舒巴坦快速檢測卡1,2-Benzanthraquinone249861,2-苯并奎寧酮

硫酸鈉快速檢測卡9-Anthracenecarboxylic acid72329-蒽甲酸

雌二醇類快速檢測試劑條Artemether719637蒿

雌三醇快速檢測試劑條Anthraquinone-carboxylic acid1178蒽醌-羧酸

克倫特羅Elisa檢測試劑盒962-(Cyanomethyl)benzimidazole441482-甲基苯并咪唑
N6-Benzoyladenine  4005-49-6  中文名：N6-苯甲酰基腺嘌呤  分子式：C12H9N5O  度：98.0%      小鼠細(xì)胞膜表面球蛋白(SmIg)ELISA試劑盒  

N6-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosine  64325-78-6  中文名：N6-苯甲?；?/span>-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脫氧腺苷  分子式：C38H35N5O6  度：98.0%      小鼠細(xì)胞間粘附分子3(ICAM-3/CD50)ELISA試劑盒           

N4-Benzoylcytosine  26661-13-2  中文名：N4-苯甲?；奏?/span>  分子式：C11H9N3O2  度：98.0%      小鼠細(xì)胞色素P450(mouse Cytochrome P450)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝

N4-Benzoylcytidine  13089-48-0  中文名：N4-苯甲酰胞苷  分子式：C16H17N3O6  度：98.0%      小鼠C反應(yīng)蛋白(mouse CRP)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝

N4-Benzoyl-2'-deoxycytidine  4836-13-9  中文名：N4-苯甲?；?/span>-2'-脫氧胞苷  分子式：C16H17N3O5  度：98.0%      小鼠CXC趨化因子受體3(mouse CXCR3)   作用：   ELISA   規(guī)格：   48T/96T   進(jìn)口分裝
胰酶(1:4500)  Pancreatin  質(zhì)量規(guī)格：酶活1:4500,BR 人促甲狀腺素受體(TSHR)抗體試劑盒 Human TSHR aibody ELISA Kit

枸櫞酸奧芬那君;枸酸芬那君  Orphenadrine   質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR 人促甲狀腺素受體(TSHR)試劑盒 Human TSHR ELISA Kit

β-半乳糖苷酶  β-Galactosidase  質(zhì)量規(guī)格：700u/mg，羅氏分裝 人促卵泡素(FSH)試劑盒 human follicle-stimulating hormone,FSH ELISA Kit

脫落酸(標(biāo)準(zhǔn)品)  Abscisic acid,S-ABA  質(zhì)量規(guī)格：98%,標(biāo)準(zhǔn)品 人促凝素(CP)試劑盒 Human Cancer Procoagula,CP ELISA Kit

脫落酸(高)  Abscisic acid,S-ABA  質(zhì)量規(guī)格：98%,BR 人促腎上皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)試劑盒 human coicoopin releasing hormone,CRH ELISA Kit

脫落酸,S-誘抗素; 壯芽靈  Abscisic acid,S-ABA  質(zhì)量規(guī)格：95%,BR 人促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)試劑盒 Human adrenocoicoopic hormone,ACTH ELISA kit

胃蛋白酶(1:3000)  PEPSIN  質(zhì)量規(guī)格：1:3000,BR 人促生長激素釋放激素(GHRH)試劑盒 Human growth hormone releasing hormone,GHRH ELISA Kit

核糖核酸酶A(sigma)  Ribonuclease A from bovine pancreas  質(zhì)量規(guī)格：≥50 U/mg,sigma 原裝 人促睡眠肽(DSIP)ELISA檢測試劑盒Humandeltasleep-inducingpeptide,DSIPELISAKit 96T/48T

S-4  Andarine  質(zhì)量規(guī)格：>98% 人促睡眠肽(DSIP)試劑盒 Human delta sleep-inducing peptide,DSIP ELISA Kit

胃蛋白酶(1:12000)  PEPSIN  質(zhì)量規(guī)格：1:12000,BR 人促胃液素受體(GsaR)ELISA檢測試劑盒Humangasieceptor,GsaRELISAKit 96T/48T
人腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞提取物培養(yǎng)Trenbolone cyclohexylmethylcarbonate  23454-33-3  中文名：群勃龍環(huán)己甲基碳酸酯  分子式：C26H34O4  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠降鈣素(CT)ELISAKit  

Trenbolone acetate  10161-34-9  中文名：  分子式：C20H24O3  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠脫氫表雄酯(DHEA-S)ELISAKit              

Trenbolone  10161-33-8  中文名：群勃龍  分子式：C18H22O2  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠孕   英文名稱：   Progesterone   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   PROG

Trehalose  99-20-7  中文名：海藻糖  分子式：C12H22O11  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠1型前膠原羧基端原肽   英文名稱：   Mouse C-Terminal Propeptide of type I collagen    規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   PICP

Trazodone hydrochloride  25332-39-2  中文名：鹽酸曲唑酮  分子式：C19H23Cl2N5O  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠甲狀旁腺激素   英文名稱：   Mouse Parathormone   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   PTH

注意事項(xiàng)：

1. 接收到，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過的）。
3.嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4.將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細(xì)胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細(xì)胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細(xì)胞。
7.換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。