PrimaCell™小鼠直腸平滑肌細胞試劑盒

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PrimaCell™小鼠直腸平滑肌細胞試劑盒

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化。生物科技提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結(jié)果等。
cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA第一鏈，以50ul總反應體系進行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應10min 后終止RT反應。利用1x RT Buffer 運輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴格的QA/QC分析，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人關節(jié)軟骨組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

細胞培養(yǎng)方法；

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細胞復蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

實驗事項；

1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數(shù)。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。
    如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數(shù)。

英文名稱HumaumornecrosisfactorsolublereceptorⅡELISAKIT人腫瘤壞死因子可溶性受體Ⅱ(TNFsRⅡ)規(guī)格：96T/48T  104012-37-5款冬酮品牌  Tussilagone

超氧化物歧化酶(SOD)活性酶動力比色法定量檢測試劑盒(含標準樣)50  404-86-4辣椒堿規(guī)格  Capsaicin

RatgranzymesA,Gzms-AELISA試劑盒大鼠顆粒酶A(Gzms-A)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T  58543-16-1萊苞迪苷A  Rebaudioside A

小鼠周期素依賴性激酶抑制因子2A(CDKN2A)ELISA試劑盒 ，英文名： CDKN2A ELISA Kit  79498-31-0藍萼甲素說明書  glaucocalyxin A

犬雙氫(DHT)ELISA檢測試劑盒CanineDihydrotestosterone,DHTELISAKit 96T/48T  11088-09-8CAS號：11088-09-8品牌  wilforine
53956-04-0甘草酸單銨鹽  Glycyrrhizic acid ammonium salt   豬透明質(zhì)酸(HA)ELISA檢測試劑盒PorcineHyaluronicacid,HAELISAKit 96T/48T

53947-92-5補骨脂寧品牌  corylin    豬鐵蛋白(FE)試劑盒 Pig ferritin,FE ELISA Kit

539-15-1大麥芽堿說明書  Hordenine   豬糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)試劑盒 Pig Glycated hemoglobin A1c,GHbA1c ELISA Kit

537-73-5異阿魏酸說明書  3-Hydroxy-4-methoxycinnamic acid  豬胎球蛋白A 試劑盒 Pig Fetuin A ELISA Kit

535-83-1葫蘆巴堿  Trigonelline   豬胎盤生長因子(PGF)試劑盒 Pig Placea growth factor,PGF ELISA kit
犬窖蛋白Caveolin-1(CAV1)試劑盒 Dog Caveolin-1,CAV1 ELISA kit  88664-08-811-羥基柳杉酚規(guī)格  11-hydroxy-sugiol

英文名稱Humanhemeoxygenase-2ELISAKit人血紅素氧合酶2(HO-2)規(guī)格：96T/48T  1352001-09-23β-乙酰氧基-7,25-甘遂二烯-24(R)-醇  3β-acetoxy-eupha- 7,25-dien-24(R)-ol

化線粒體呼吸控制率(RCR)定量檢測試劑盒20  26791-73-1蒼耳亭說明書  Xanthatin

RatInsulin-likegrowthfactorbindingprotein2,IGFBP-2ELISA試劑盒大鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T  140670-84-4Levatin品牌  Levatin

小鼠載脂蛋白C4(APOC4)ELISA試劑盒 ，英文名： APOC4 ELISA Kit  76475-17-7Croverin規(guī)格  Croverin
PrimaCell™小鼠直腸平滑肌細胞試劑盒331-39-5咖啡酸品牌  Caffeic acid  雜交清洗液500毫升

33069-62-4紫杉醇規(guī)格  Taxol  遠西方雜交(FARWESTERNBLOT)印跡消除試劑盒20

32981-86-510-脫乙酰基巴卡丁III  Deacetylbaccatin III   原生質(zhì)酵母細胞轉(zhuǎn)化試劑盒20

327-97-9綠原酸說明書  Chlorogenic acid  元素檢測樣品處理試劑盒20

32791-84-7人參三醇品牌  Panaxatriol  玉米樣品處理試劑盒20

注意事項；

1. 接收到，肉眼觀察細胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過的）。
3.嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶。
4.將細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細胞。
7.換新的細胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。