PrimaCell™大鼠角膜上皮細胞試劑盒

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PrimaCell™大鼠角膜上皮細胞試劑盒

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化。生物科技提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結果等。
cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA第一鏈，以50ul總反應體系進行逆轉錄，體系中包括MMLV反轉錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應10min 后終止RT反應。利用1x RT Buffer 運輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應。所有cDNA產品在訂單發貨之前都經過了嚴格的QA/QC分析，保證了產品的質量。
蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人關節軟骨組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

細胞培養方法；

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。
2、細胞復蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

實驗事項；

1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)好控制在10分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態;同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
    如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數。

英文名稱HumanAngiopoietin-1ELISAKit人血管生成素-1(ANG-1)規格：96T/48T  572-30-5扁蓄苷品牌  Avicularin

化線粒體膜通道孔(MPTP)比色法檢測試劑盒20  105454-04-47-表紫杉醇規格  7-Epitaxol

Ratiercellularadhesionmolecule1,ICAM-1ELISA試劑盒大鼠細胞間粘附分子1(ICAM-1/CD54)ELISA試劑盒規格：96T/48T  78432-77-610-去乙酰紫杉醇  Deacetyltaxol

小鼠載脂蛋白A2(APOA2)ELISA試劑盒 ，英文名： APOA2 ELISA Kit  114977-28-5多烯紫杉醇說明書  Docetaxel

猴胰島素(INS)ELISA檢測試劑盒MonkeyInsulin,INSELISAKit 96T/48T  71610-00-9三尖杉寧堿品牌  Cephalomannine
148244-82-0亞麻木酚素說明書  Secoisolariciresinol Diglucoside  英文名稱Rathemeoxygenase-1ELISAKit大鼠血紅素氧合酶1(HO-1)規格：96T/48T

146501-37-3沙苑子苷A說明書  Complanatoside A  英文名稱RatHeatShockProtein90ELISAKit大鼠熱休克蛋白90(HSP90)ELISA試劑盒規格：96T/48T

14605-22-2牛磺熊去氧膽酸規格   Tauroursodeoxycholic acid   英文名稱RatHeatShockProtein90ELISAKit大鼠熱休克蛋白90(HSP90)ELISA試劑盒規格：96T/48T

145572-44-7槐果堿規格  Sophocarpine   英文名稱RatHeatShockProtein70ELISAKit大鼠熱休克蛋白70(HSP70)規格：96T/48T

1453-93-6原人參三醇說明書  Protopanaxatriol  英文名稱RatHeatShockProtein70ELISAKit大鼠熱休克蛋白70(HSP70)規格：96T/48T
英文名稱HumanangiotensionⅠELISAKit人血管緊張素I(AngI)規格：96T/48T  63238-66-4苯甲酰烏頭原堿品牌  Benzoylhypacoitine

化線粒體氧化應激活性氧(ROS)初級熒光測定試劑盒20  烏頭原堿規格  Hypaconine

Ratierferon-inducibleprotein16,IFI16/p16ELISA試劑盒大鼠γ干擾素誘導蛋白16/p16(IFI16/p16)ELISA試劑盒規格：96T/48T  28-去甲基-β-香樹脂酮  28-demethyl -β-amyrone

小鼠硬骨素(SOST)ELISA試劑盒 ，英文名： SOST ELISA Kit  71486-22-1長春瑞濱說明書  Vinorelbine

壞死因子相關凋亡誘導配體3(AIL-R3)ELISA檢測試劑盒Rabbittumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand3,AIL-R3ELISAKit 96T/48T  2068-78-2硫酸長春新堿品牌  Vincristine Sulphate
PrimaCell™大鼠角膜上皮細胞試劑盒81907-62-2靈芝酸A  Ganoderic Acid A   組織CHK2激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20

81907-61-1靈芝酸B說明書  Ganoderic acid B   組織CDK7/CYCLINH激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20

81740-07-0白花前胡乙素品牌  Praeruptorin B   組織CDK6/CYCD1激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20

81720-08-3地黃苷D  Rehmannioside D   組織CDK5/P25激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20

81720-05-0地黃苷A規格  Rehmannioside A   組織CDK3/CYCLINE激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20

注意事項；

1. 接收到，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過的）。
3.嚴格無菌操作，打開細胞培養瓶。
4.將細胞培養瓶內的培養基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養基培養細胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細胞變圓，輕輕拍打培養瓶直到細胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細胞。
7.換新的細胞培養瓶，37℃，5%CO2培養。