PrimaCell™人結腸平滑肌細胞試劑盒說明書

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PrimaCell™人結腸平滑肌細胞試劑盒

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化。生物科技提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結果等。
cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA第一鏈，以50ul總反應體系進行逆轉錄，體系中包括MMLV反轉錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應10min 后終止RT反應。利用1x RT Buffer 運輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應。所有cDNA產品在訂單發貨之前都經過了嚴格的QA/QC分析，保證了產品的質量。
蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人關節軟骨組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

細胞培養方法；

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。
2、細胞復蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

實驗事項；

1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)好控制在10分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態;同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
    如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數。

RatFibrinogenDegradationProduct,FDPELISA試劑盒大鼠血纖蛋白原降解產物(FDP)ELISA試劑盒規格：96T/48T  201-482-7豆甾醇  Stigmasterol

小鼠組織金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP1)ELISA試劑盒 ，英文名： TIMP1 ELISA Kit  303-45-7棉酚說明書  Gossypol

綿羊白介素2受體(IL-2R)ELISA檢測試劑盒SheepIerleukin-2receptor,IL-2RELISAkit 96T/48T  12542-36-8醋酸棉酚品牌  Gossypol acetic acid

犬胰高血糖素樣肽1(GLP1)試劑盒 Dog glucagon like peptide 1,GLP1 ELISA Kit  6812-81-3櫟癭酸規格  Roburic acid

英文名稱MouseAdenosineiphosphataseELISAKit小鼠ATP酶規格：96T/48T  81907-62-2靈芝酸A  Ganoderic acid A
光翠雀堿說明書  denudatine   組織尿激酶(UROKINASE)活性熒光定量檢測試劑盒20

二氫青蒿酸規格  Dihydroartemisinic acid    組織尿激酶(UROKINASE)活性比色法定量檢測試劑盒20

二氫姜黃素  Dihydrocurcumin   組織逆轉錄酶(REVERSEANSCREPTASE)活性熒光定量檢測試劑盒20

莪術烯醇品牌    組織內質網內鈣離子濃度熒光檢測試劑盒20

冬青素A品牌  Ilexgenin A  組織鎂離子濃度酶反應光譜法定量檢測試劑盒20
RabbitoponinⅠ,Tn-ⅠELISAKit兔肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)ELISA試劑盒規格：96T/48T  481-74-3大黃酚  Chrysophanol

載玻片細胞ERBETA蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒10/20  518-82-1大黃素說明書  Emodin

humanβ2-microglobulin,BMG/β2-MGELISA試劑盒人β2微球蛋白(BMG/β2-MG)ELISA試劑盒規格：96T/48T  478-43-3大黃酸品牌  Rhein

小鼠阻抑素(PHB)ELISA試劑盒 ，英文名： PHB ELISA Kit  38840-23-2大黃素-1-O-葡萄糖苷規格  Emodin-1-O-glucoside

貓α干擾素(IFN-α)ELISA檢測試劑盒FelisIerferonα,IFN-αELISAKit 96T/48T  23313-21-5大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷  Emodin-8-glucoside
PrimaCell™人結腸平滑肌細胞試劑盒說明書115-53-7青藤堿  Sinomenine  英文名稱RatdopamineELISAKit大鼠多巴胺(dopamine)規格：96T/48T

114977-28-5多烯紫杉醇說明書  Docetaxel   英文名稱Ratdihy-drotestosteroneELISAKit大鼠雙氫睪同(DHT)規格：96T/48T

114977-28-5多烯紫杉醇  Docetaxel,DOC   英文名稱Ratdihy-drotestosteroneELISAKit大鼠雙氫睪同(DHT)規格：96T/48T

114902-16-8太子參環肽B品牌  Heterophyllin B    英文名稱RatDHEA-SELISAKit大鼠去氫表雄同(DHEA-S)規格：96T/48T

114902-16-8刺五加皂甙B品牌  Ciwujianoside B   英文名稱RatDHEA-SELISAKit大鼠去氫表雄同(DHEA-S)規格：96T/48T

注意事項；

1. 接收到，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過的）。
3.嚴格無菌操作，打開細胞培養瓶。
4.將細胞培養瓶內的培養基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養基培養細胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細胞變圓，輕輕拍打培養瓶直到細胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細胞。
7.換新的細胞培養瓶，37℃，5%CO2培養。