人脈絡(luò)膜血管細胞提取物培養(yǎng)

人脈絡(luò)膜血管細胞提取物【Human Eyes: Normal Choroidal Vascular Cells Derivatives】

人脈絡(luò)膜血管細胞提取物是從人原代脈絡(luò)膜血管細胞提取的，人原代脈絡(luò)膜血管細胞從正常人脈絡(luò)膜血管組織制備。正常人脈絡(luò)膜血管組織采集自各地方醫(yī)院，采集工作根據(jù)IRB 和 HIPAA批準的方案進行。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過嚴格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆，表達圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實驗的研究。

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化。生物科技提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結(jié)果等。
cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA第一鏈，以50ul總反應(yīng)體系進行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴格的QA/QC分析，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人關(guān)節(jié)軟骨組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

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細胞培養(yǎng)方法：
1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

實驗事項：

1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數(shù)。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。
    如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 接收到，肉眼觀察細胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過的）。
3.嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶。
4.將細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細胞。
7.換新的細胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。 

雙面架(S,S),6-Bis(4-isopropyl-oxazolin-yl)pyridine1189491(S,S),6-雙(4-異丙基-惡唑啉-基)吡啶

四色廣泛pH試紙 1條/盒 N-[Bis(methylthio)methylene]- p-sulfonamide26515N-[雙(甲硫基)亞甲基]對甲苯磺酰胺

塑料方形培養(yǎng)皿 ×cm 0套/箱4,4'-Bis(5-methyl-benzoxazolyl)stilbene2394,4'-雙(5-甲基-苯并惡唑基)芪

塑料方形培養(yǎng)皿 13×13cm1套/箱 Bis(2,6-diisopropylphenyl)carbodiimide21624雙(2,6-二異基)碳二亞胺

塑料下口瓶5L/L/L/LN,N-Bis(2-chloroethyl)-p-sulphonamide421378N,N-雙(2-氯乙基)對甲苯磺酰胺
N-Acetyl-D-tryptophan  2280/1/5  中文名：N-乙酰基-D-色氨酸  分子式：C13H14N2O3  度：99.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠抗可提取核抗原抗體ENA抗體   英文名稱：   Mouse Exactable Nuclear Aibody   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   ENA

N-Acetylcaprolactam  1888-91-1  中文名：N-乙酰己內(nèi)酰胺  分子式：C8H13NO2  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠β內(nèi)啡肽   英文名稱：   Beta-Endorphin   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   β-EP

N-Acetyl-5-hydroxytryptamine  1210-83-9  中文名：N-乙酰基-5-羥基色胺  分子式：C12H14N2O2  度：99.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠表皮生長因子   英文名稱：   epidermal growth factor-like growth factor   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   EGF

N-6-Methyl-7,7-dioxo-2-sulfamoyl-5,6-dihydro-4H-thieno[2,3-b]thiopyran-4-yl]acetamide  147200-03-1  中文名：  分子式：C10H14N2O5S3  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠細胞色素氧化酶（CC0）ELISA試劑盒  

N6-Benzyladenine  1214-39-7  中文名：N6-芐基腺嘌呤  分子式：C12H11N5  度：98.0%      小鼠細胞色素C(Cyt-C)ELISA試劑盒
乙酸鈉三水(分子生物學(xué)級)   acetate, trihydrate  質(zhì)量規(guī)格：>99%,分子生物學(xué)級 蛋白樣品多粘菌素層析法去內(nèi)試劑盒20

脫葉靈,噻苯隆  Thidiazuron  質(zhì)量規(guī)格：>98%,分子生物學(xué)級 蛋白樣品賴氨酸層析法去內(nèi)試劑盒20

(AR)  Iodine  質(zhì)量規(guī)格：>99.5%,AR 蛋白樣品賴氨酸層析法去內(nèi)試劑盒20

乙醇脫氫酶  ADA, Alcohol dehydrogenase   質(zhì)量規(guī)格：>300U/mg,BR 蛋白樣品樹脂法去內(nèi)試劑盒20

吐溫80(化學(xué))  Tween-80  質(zhì)量規(guī)格：CP 蛋白樣品樹脂法去內(nèi)試劑盒20

吐溫80(藥用級)  Tween-80  質(zhì)量規(guī)格：藥用級 蛋白樣品液相法去內(nèi)試劑盒20

吐溫80(細胞培養(yǎng)級)  Tween-80  質(zhì)量規(guī)格：細胞培養(yǎng)級 蛋白樣品液相法去內(nèi)試劑盒20

葡萄糖酸鉀(AR)  Potassium-D-gluconate  質(zhì)量規(guī)格：AR 蛋白質(zhì)A標記二抗(抗人;抗兔;抗小鼠;抗大鼠)100微升

PF-562271  PF562271  質(zhì)量規(guī)格：>98%，FAK抑制劑 蛋白質(zhì)西方雜交10倍清理緩沖液500毫升

海藻酸鈉   alginate from brown;Algin  質(zhì)量規(guī)格：BR,度>98% 蛋白質(zhì)西方雜交10倍印跡膜轉(zhuǎn)移緩沖液500毫升
人脈絡(luò)膜血管細胞提取物培養(yǎng)Tranexamic acid  1197-18-8  中文名：凝血酸  分子式：C8H15NO2    鐵測試盒   Iron test case

2-Aminonicotinic acid  5345-47-1  中文名：2-氨基煙酸  分子式：C6H6N2O2    錳測試盒   Manganese test case

6'-Amino-3',4'-(methylenedioxy)acetophenone  28657-75-2  中文名：6'-氨基-3',4'-(亞甲基二氧代)苯乙酮  分子式：C9H9NO3    鎳測試盒   Nickel test case

2-Amino-3-methylbenzoic acid  4389-45-1  中文名：2-氨基-3-甲基苯甲酸  分子式：C8H9NO2    鹽快速測試盒   Niate rapid test case              

5-Aminouracil  932-52-5  中文名：5-氨基尿嘧啶  分子式：C4H5N3O2    調(diào)節(jié)活化蛋白   英文名稱：   Human Raes   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   RAES