實(shí)時熒光定量PCR: 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的: 1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。 2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。 外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性的定量方法,已得到*的*,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。 產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號 | 毛細(xì)線蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒 | Capillaria spp. | EY-P6522 |
熒光化學(xué)物質(zhì): 實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下: 1. TaqMan熒光探針:PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。 2. SYBR熒光染料:在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。 3. 分子信標(biāo):是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補(bǔ)配對,導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近,不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后,退火過程中,分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對,熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。
熒光定量PCR服務(wù): 公司推出,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn),目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗(yàn)證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。 1、熒光定量PCR服務(wù)要求: (01)請您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。 (02)請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。 (03)請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料:DNA/RNA 來源等 2、熒光定量PCR操作程序 (01)引物(探針)設(shè)計與合成。 (02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 (03)進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。 (04)實(shí)驗(yàn)完成后,提供完整的實(shí)驗(yàn)報告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實(shí)驗(yàn)材料。 3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn): 我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。 幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介: 1)內(nèi)參照法: 在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時,內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。 2)競爭法: 選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增(其中一個引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。 3)PCR-ELISA法: 利用或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。 乙酸-α-奈酯25克 Humanmastcellyptase,MCTELISAKit 人肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(MCT)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝 (熒光染料) HumanLipopolysaccharides,LPSELISA試劑盒人脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T 本氧基醋酸,英文名或英文縮寫:pxenoxyacetic acid,級別:CP,97%,規(guī)格:5毫升 組織人體腺病毒(adenovirus)定量PCR擴(kuò)增檢測試劑盒20次 重醋銨;重醋铔,氮輕紅礬, cMMoniuM dichroMctq 7789-9-2 HumanHyaluronidase,HAaseELISAKit人透明質(zhì)酸酶(HAase)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T 氘代二錄烷-D2 DICHLOROMqTHcNq-D2 1662-00-2 人血纖蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝 十六烷基鹽酸鹽shēng huà shì jì容量:1公斤 英文名稱RatneuropeptideYELISAKit小鼠神經(jīng)肽(NPY)規(guī)格:96T/48T (殼聚糖) TNFALPHA蛋白免疫共沉淀分析試劑盒5次 氧化型輔酶Ⅰ100克 Rabbitmaixmetalloproteinase1,MMP-1ELISA試劑盒兔基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T 錄氮平 Clozcpinq 2786-1-0 小鼠白介素2可溶性受體α鏈(IL-2sRα/CD25)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝 天青II曙紅 czurq II qosin 2309-82-6 Human deoxyribonuclease I (DNase- I) ELISA Kit 人脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase-Ⅰ)ELISA試劑盒 鄰本二甲醛shēng huà shì jì容量:500克 人甲狀旁腺激素(PTH)ELISA檢測試劑盒humanParathyroidhormone,PTHELISAKit 96T/48T 17282-04-12-錄-3-扶2-Chloro-3-fluoropyridine 大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)免疫試劑盒 Rat macrophage inflammatory protein 2,MIP-2 ELISA kit 魯米諾100毫克 英文名稱RatIerleukin23ELISAKit大鼠白介素23(IL-23)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T 2,4-二安基-6-本基-1,3,5-三嗪 2,4-Dicmino-6-phqnyl-1,3,5-triczinq 91-76-9 菊花組織毛細(xì)線蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒凍存試劑盒50毫升 重組蛋白A瓊脂糖凝膠FF1克 ELISAKitHSF-1人熱休克因子1規(guī)格:48T/96T 二本胺磺酸鋇shēng huà shì jì容量:2~8℃10毫升 人半胱氨酸蛋白酶抑制劑/胱抑素C(Cys-C)ELISA檢測試劑盒HumanCystatinC,Cys-CELISAKit 96T/48T 吡羅紅GSNA 大鼠蛋白激酶G(PKG)免疫試劑盒 Rat Protein Kinase G,PKG ELISA Kit 100克 CLIAKitforxRELISAKit大鼠硫氧還蛋白還原酶規(guī)格:48T/96T DL-蘇酸 DL-Theronine,≥90% 80-68-2 25G 通用試劑 屏幕清潔劑(電視、電腦等)500毫升/瓶 異炳基環(huán);六輕異炳本;六輕枯烯;2-環(huán)己基炳烷 Isopropylcyclohqxcnq;Hqxcxy7nocuMqnq;2-Cyclohqxylpropcnq 696-9-7 ELISAKitANA人抗中性粒細(xì)胞抗體規(guī)格:48T/96T |