PrimaCell™大鼠肺成纖維細(xì)胞試劑盒培養(yǎng)

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PrimaCell™大鼠肺成纖維細(xì)胞試劑盒

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。生物科技提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測(cè)定結(jié)果等。
cDNA制備：純化后的總RNA來(lái)合成cDNA第一鏈，以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運(yùn)輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的QA/QC分析，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人關(guān)節(jié)軟骨組織裂解液，離心去除組織碎片，通過(guò)Bio-Rad蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

細(xì)胞培養(yǎng)方法；

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細(xì)胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；
③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

實(shí)驗(yàn)事項(xiàng)；

1. 試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。  實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時(shí)，請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí)，前一個(gè)孔與后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育"時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測(cè)溶液A時(shí)，一次不要小于10μl)，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。
6.  反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7.  底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
    建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
    如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)后乘以稀釋倍數(shù)。

英文名稱HumanInsulin-likegrowthfactor1,IGF-1ELISAKit人胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)ELISAKit規(guī)格：96T/48T  877822-40-7野馬追內(nèi)酯B  Eupalinolide B

化人體RUNX3基因重組表達(dá)載體(pGEFP-RUNX3)測(cè)序引物對(duì)2OD  17306-46-6野漆樹(shù)苷說(shuō)明書(shū)  Rhoifolin

Rathypoxia-induciblefactor1α,HIF-1αELISA試劑盒大鼠低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T  6926-14-3乙酰哈巴苷品牌  Acetylharpagide

小鼠整合素α1(ITGα1)ELISA試劑盒 ，英文名： ITGα1 ELISA Kit  18797-80-3乙酰紫堇靈規(guī)格  Acetylcorynoline

促卵泡素(FSH)ELISA檢測(cè)試劑盒Monkeyfollicle-stimulatinghormone,FSHELISAKit 96T/48T  79559-55-0乙氧基白屈菜紅堿  Ethoxychelerythrine
28808-62-0梣酮品牌  Fraxinellone   英文名稱RatVitaminB6ELISAKit大鼠維生素B6(VB6)規(guī)格：96T/48T

28649-60-7環(huán)氧續(xù)隨子醇品牌  Epoxylathyrol    英文名稱RatVIII-AgELISAKit大鼠凝血因子VIII相關(guān)抗原(VIII-Ag)規(guī)格：96T/48T

28608-75-5葒草苷說(shuō)明書(shū)  Orientin   英文名稱RatVIII-AgELISAKit大鼠凝血因子VIII相關(guān)抗原(VIII-Ag)規(guī)格：96T/48T

28543-07-9茶黃素-3＆#146;-沒(méi)食子酸酯說(shuō)明書(shū)  Theaflavin-3＆#146;-Gallate  (TF-3＆#146;-G)   英文名稱RatVasoactiveIestinalPeptideELISAKit大鼠血管活性腸肽(VIP)規(guī)格：96T/48T

28282-25-9β-欖香酮酸品牌  β-EleMonic acid    英文名稱RatVasoactiveIestinalPeptideELISAKit大鼠血管活性腸肽(VIP)規(guī)格：96T/48T
小鼠載脂蛋白A1(APOA1)ELISA試劑盒 ，英文名： APOA1 ELISA Kit  861691-37-4葒草素-2"-0-B-L半乳糖苷說(shuō)明書(shū)  2"-O-beta-L-galactopyranosylorientin

猴γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測(cè)試劑盒MonkeyIerferonγ,IFN-γELISAKit 96T/48T  219944-46-4七葉皂苷D品牌  AescinIIB

犬基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/Gelatinase B)試劑盒 Dog maix metalloproteinase 9/Gelatinase B,MMP-9 ELISA Kit  158732-55-9七葉皂苷C規(guī)格  Aescin IIA

英文名稱HumanVascuolarcelladhesionmolecule1ELISAkit人血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)ELISAkit規(guī)格：96T/48T  土槿皮乙酸-葡萄糖苷  Pseudolaric acid B-O-β-D-glucopyranoside

化線粒體內(nèi)膜功能/膜電位測(cè)定試劑盒100  114590-20-4大豆皂苷Ba說(shuō)明書(shū)  Soyasaponin Ba
PrimaCell™大鼠肺成纖維細(xì)胞試劑盒培養(yǎng)568-72-9丹參酮IIA  Tanshinone IIA   豬血纖蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)試劑盒 Porcine Fibrinogen Degradation Product,FDP ELISA Kit

56725-99-6羊藿苷I規(guī)格  Icarisid I  豬血纖蛋白原(Fbg)ELISA檢測(cè)試劑盒PorcineFibrinogen,FbgELISAKit 96T/48T

5610-40-2一葉萩堿規(guī)格  Securinine   豬血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)試劑盒 Porcine thrombomodulin,TM ELISA Kit

55916-51-3重樓皂苷VI規(guī)格  Polyphyllin VI  豬血栓素A2(TXA2)試劑盒 Pig Thromboxane A2,TXA2 ELISA Kit

5578-73-4血根堿規(guī)格  Sanguinarine  豬血清淀粉樣蛋白A(SAA)試劑盒 Pig serum amyloid A,SAA ELISA Kit

注意事項(xiàng)；

1. 接收到，肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時(shí)的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時(shí)的細(xì)胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過(guò)的）。
3.嚴(yán)格無(wú)菌操作，打開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4.將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴(yán)禁直接傾倒），放入另一無(wú)菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細(xì)胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細(xì)胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細(xì)胞。
7.換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。