PrimaCell™大鼠結腸平滑肌細胞試劑盒培養

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PrimaCell™大鼠結腸平滑肌細胞試劑盒

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化。生物科技提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結果等。
cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA第一鏈，以50ul總反應體系進行逆轉錄，體系中包括MMLV反轉錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應10min 后終止RT反應。利用1x RT Buffer 運輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應。所有cDNA產品在訂單發貨之前都經過了嚴格的QA/QC分析，保證了產品的質量。
蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人關節軟骨組織裂解液，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF，-80度保存。

細胞培養方法；

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；
⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。
2、細胞復蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。
3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種
①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；
③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

實驗事項；

1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)好控制在10分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態;同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
    如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數。

RatImmunoglobulinE,IgEELISA試劑盒大鼠球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒規格：96T/48T  29702-25-8異牡荊苷  Isovitexin

小鼠長停滯特異性基因產物6(gas-6)ELISA試劑盒 ，英文名： gas-6 ELISA Kit  486-21-5異嗪皮啶說明書  Isofraxidin

小鼠抗子宮內膜抗體(EMAb)ELISA檢測試劑盒MouseEndomeiumAibody,EMAbELISAKit 96T/48T  51014-29-0異去氫鉤藤堿品牌  Isocorynoxeine

人巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)試劑盒 Human M-CSF ELISA kit  480-19-3異鼠李素規格  Isorhamnetin

RatAlternativemacrophageactivation-associatedCCchemokine1,AMAC-1ELISAKit大鼠巨噬細胞替代激活相關化學因子1(AmAC-1)ELISA試劑盒規格：96T/48T  55033-90-4異鼠李素-3-O-新橙皮苷  Isorhamnetin-3-O-neohespeidoside
27200-12-0二氫楊梅素規格  Dihydromyricetin   英文名稱RatTissuePolypeptideAigenELISAKit大鼠組織多肽抗原(TPA)ELISAKit規格：96T/48T

27013-91-8α-常春藤皂苷規格  α-hederin   英文名稱RatTissuefactorpathwayinhibitorELISAKit大鼠組織因子途徑抑制物(TFPI)規格：96T/48T

26904-64-3氧化槐果堿說明書  Oxysophocarpine   英文名稱RatTissuefactorpathwayinhibitorELISAKit大鼠組織因子途徑抑制物(TFPI)規格：96T/48T

26833-87-4高三尖杉酯堿  Homoharringtonine   英文名稱Ratthyroopin-releasinghormoneELISAKit大鼠促甲狀腺素釋放激素(H)ELISA試劑盒規格：96T/48T

2680-81-1去氫二異丁香酚品牌  Dehydrodiisoeugenol  英文名稱Ratthyroopin-releasinghormoneELISAKit大鼠促甲狀腺素釋放激素(H)ELISA試劑盒規格：96T/48T
小鼠再生胰島衍生蛋白3γ(REG3γ)ELISA試劑盒 ，英文名： REG3γ ELISA Kit  135247-95-9白頭翁皂苷B說明書  Pulchinenoside B

白介素2受體(IL-2R)ELISA檢測試劑盒MonkeyIerleukin-2receptor,IL-2RELISAkit 96T/48T  14216-03-6常春藤苷C品牌  Hederacoside C

犬抗利尿激素/血管加壓素/精氨酸加壓素(AVP)試劑盒 Dog arginine vasopressin,AVP ELISA kit  366814-42-8苦蘇花皂苷C規格  Cussosaponin C

英文名稱HumanPAFELISAKit人血小板活化因子(PAF)ELISAKit規格：96T/48T  128730-82-5常春藤苷H  Kalopanaxsaponin H

化線粒體II型L-3羥酰基-CoA脫氫酶/β淀粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶(HADHII/ABAD)活性比色法定量檢測試劑盒20  173220-07-0構樹堿A說明書  Broussonetine A
PrimaCell™大鼠結腸平滑肌細胞試劑盒培養58479-68-8桔梗皂苷D規格  Platycodin D   豬胰高血糖素樣肽2(GLP2)試劑盒 Pig glucagon like peptide 2,GLP2 ELISA kit

5843-65-2去甲烏藥堿品牌  Higenamine  豬胰高血糖素樣肽1(GLP1)試劑盒 Pig glucagon like peptide 1,GLP1 ELISA Kit

58316-41-9柴胡皂苷B2說明書  Saikosaponin B2   豬胰高血糖素(GC)試劑盒 Pig Glucagon,GC ELISA Kit

578-86-9甘草素規格  Liquiritigenin   豬胰淀粉酶α2(PAMY α2)試劑盒 Pig Pancreatic Amylase α2,PAMY α2 ELISA Kit

57-87-4甾醇規格  Ergosterol  豬胰島素原(PI)試劑盒 Pig Proinsulin,PI ELISA Kit

注意事項；

1. 接收到，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞100X,200X各一張）。
2.用75%的酒精消毒（建議配置75%的酒精的水是滅菌過的）。
3.嚴格無菌操作，打開細胞培養瓶。
4.將細胞培養瓶內的培養基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養基培養細胞）。
5.用PBS 2-3ml/次輕輕洗細胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,顯微鏡下觀察細胞變圓，輕輕拍打培養瓶直到細胞脫落，加入終止液終止。
6.1000rpm，5min離心，重懸細胞。
7.換新的細胞培養瓶，37℃，5%CO2培養。