Cas9穩(wěn)定表達(dá)的人肺癌細(xì)胞；A549-Cas9-538

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）Cas9穩(wěn)定表達(dá)的人肺癌細(xì)胞；A549-Cas9-538圖片準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
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產(chǎn)品描述：
細(xì)胞名稱 Cas9穩(wěn)定表達(dá)的人肺癌細(xì)胞；A549-Cas9-538圖片
形態(tài)特性上皮樣；多角

生長特性貼壁生長

特征特性該細(xì)胞是采用慢病毒感染的方式使A549細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Cas9-Flag-Neo，經(jīng)400ug/mlG418篩選得到的單克隆，經(jīng)WesternBlotting驗(yàn)證該克隆可以表達(dá)Cas9蛋白，可直接用Crispr技術(shù)編輯基因組DNA。

培養(yǎng)條件McCoy's5AMedia(ModifiedwithTricine)10%FBS；400ug/mlG418

傳代方法1:3~1：8傳代；每周2~3次。

傳代情況C3

凍存條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%DMSO+20%FBS

支原體檢測(cè)培養(yǎng)法（-）

STRAmelogenin：X,Y；CSF1PO：10,12；D12S391：18,19；D13S317：11,11；D16S539：11,12；D18S51：14,17；D19S433：29,29；D21S11：29,29；D2S1338：24,24；D3S1358：16,16；D5S818：11,11；D6S1043：11,13；D7S820：8,11；D8S1179：13,14；FGA：23,23；PentaE：7,11；TH01：8,9.3；TPOX：8,11；vWA：14,14；

同工酶

染色體

注意事項(xiàng)：
?1.一般客戶拿到Cas9穩(wěn)定表達(dá)的人肺癌細(xì)胞；A549-Cas9-538圖片后，應(yīng)該注意什么？
客戶收到細(xì)胞先不開蓋，放在培養(yǎng)箱靜置若干小時(shí)后（看細(xì)胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議受收細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各一張），排除細(xì)胞本身污染的情況；收到細(xì)胞未開封，出現(xiàn)污染狀況我們負(fù)責(zé)免費(fèi)發(fā)送一株細(xì)胞。
收到細(xì)胞時(shí)如無異常情況，請(qǐng)?jiān)陲@微鏡下觀察細(xì)胞密度，如為貼壁細(xì)胞，未超過80%匯合度時(shí)，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；超過80%匯合度時(shí)，請(qǐng)按細(xì)胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。如為懸浮細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后移回培養(yǎng)瓶。
細(xì)胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些？
（1）客戶造成細(xì)胞污染，不重發(fā)；
（2）客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；
（3）非推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；
（4）細(xì)胞狀態(tài)不好，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的，不重發(fā)；
（5）細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理的，不重發(fā)；
（6）細(xì)胞收到2天內(nèi)，未告知，不重發(fā)；
（7）視具體情況而定。
C3bR*人補(bǔ)體片段3b受體規(guī)格48T/96T

CCP*人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白規(guī)格48T/96T

C4*人補(bǔ)體蛋白4規(guī)格48T/96T

C3*人補(bǔ)體蛋白3規(guī)格48T/96T

C7*人補(bǔ)體7規(guī)格48T/96T

C3SP*人補(bǔ)體3裂解產(chǎn)物規(guī)格48T/96T

C1INH*人補(bǔ)體1抑制物抗體規(guī)格48T/96T

VN/CD51+CD61*人玻連蛋白/體外粘連蛋白規(guī)格48T/96T

VIM*人波形蛋白規(guī)格48T/96T

HCV-IgM*人丙型肝炎IgM規(guī)格48T/96T
Cas9穩(wěn)定表達(dá)的人肺癌細(xì)胞；A549-Cas9-538圖片*Anti-CD117/c-kit/SCFR干細(xì)胞生長因子受體/細(xì)胞表面分化抗原抗體規(guī)格：0.1ml

*Anti-phospho-c-kit(Tyr936)磷酸化原癌基因c-kit抗體規(guī)格：0.1ml

*Anti-Phospho-c-Kit(Tyr703)磷酸化原癌基因c-kit抗體規(guī)格：0.1ml

*Anti-Phospho-c-Kit(Tyr719)磷酸化原癌基因c-kit抗體規(guī)格：0.1ml

*Anti-CD133antigen造血干細(xì)胞抗原CD133抗體規(guī)格：0.1ml

*Anti-CD137/TNFRSF9CD137抗體規(guī)格：0.2ml

*Anti-CD138/Syndecan-1多配體蛋白聚糖1抗體規(guī)格：0.2ml

*Anti-CD146/MCAM黑色素瘤細(xì)胞粘附分子CD146抗體規(guī)格：0.2ml

*Anti-CD141/THBD凝血調(diào)節(jié)蛋白抗體規(guī)格：0.1ml

*Anti-CD13/ANPENCD13氨肽酶N抗體規(guī)格：0.1ml
冷凍保存細(xì)胞之方法：
Cas9穩(wěn)定表達(dá)的人肺癌細(xì)胞；A549-Cas9-538圖片冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。