豬細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒 【產品名稱】 商品名稱：豬細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒 Name ：Porcine Parvovirus (PPV) Probe qPCR Kit 【包裝規格】50 次/盒 【產品及特點】 豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)會引起豬細小病毒病。這是一種豬繁殖 障礙病，該病主要表現為胚胎和胎兒的感染和死亡，特別是初產母豬發生死胎、畸 形胎和木乃伊胎，但母豬本身無明顯的癥狀。豬群暴發此病時常與窩仔數減少、母 豬難產和重復配種等臨床表現有關。在懷孕早期 30-50 天感染，胚胎死亡或被吸 收，使母豬不孕和不規則地反復發情，該病毒會給養豬業帶來巨大的經濟損失，因 此豬細小病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本公司開發豬細 小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點： 1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。 2.引物和探針經過優化，靈敏性高。 3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。 4.特異性高，引物是根據豬細小病毒 DNA 高度保守區設計，不會跟其他微生物 DNA 發生交叉反應。 5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數 量級 6.本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。 7.本產品只能用于科研。 【規格及成分】 成分 包裝 2×Probe qPCR Magic Mix 500 μL（紅蓋） 熒光 PCR 專用模板稀釋液 1 mL（綠蓋） 超純水 1ml（白蓋） 豬細小病毒探針法 qPCR 引物-探針 混合液 150 μL（棕色蓋） 豬細小病毒探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E7 拷貝/μL) 50 μL（黃蓋） 使用手冊 1 份 【運輸及保存】 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。 【自備試劑】 樣品 DNA。 【使用方法】 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例） 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污 染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原 本產品不 提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。 1.標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。 2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭下同）。 3.在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分 鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。 4.換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充 分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。 5.換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充 分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。 6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。 二、樣品 DNA 的制備 7.如果有 N 個樣品待提取，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備 陽性對照），和 NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液 10 μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為 PC。另 外用水作為 NC。 8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。 三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行） 9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用 于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其 中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模 板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面 只以定量分析為例描述操作步驟。 10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完 畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）： 成分/每管 樣品管 N+2 個 PCR 陰 性對照管 標準曲線樣品 管（1-6 管） 2×Probe qPCR Magic Mix 10 μL 10 μL 10 μL 豬細小病毒探針法 qPCR 引物-探針 混合液 3 μL 3 μL 3 μL N+2 個待測 DNA 模板 7 μL - - 超純水 - 7 μL - 第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液 （1-6 號） - - 7 μL（1 號樣到 1 號管，2 號樣到 2 管…） 11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR： 過程 溫度 時間 預變性 95℃ 10 min PCR 反應 （45 個循環） 95℃ 15sec 55℃ 30sec 72℃ 40sec（采集 FAM 通道的熒光信號） 四、數據處理 12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度 的 log 值，再推算出其濃度。 13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于 或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等 于 35。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則 為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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