標本采集保存不當致細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，會產生假陽性反應；標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合，易使間接法的試驗本底加深。因此，標本宜在新鮮時檢測。
反復凍融血清會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。
2、加樣
如果 樣品稀釋液少加或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規定的稀釋倍數，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。
如果加入的酶結合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。
如果血液未開始凝固或凝固不*時就強行離心分離血清，此時的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果。
3. 溫育
由于ELISA試驗在一定溫度下的反應時間并不是反應的終點，溫育時間過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時間過長、溫度過高，易致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*，產生陰性高值或假陽性反應。因此，要嚴格按規定的溫度和溫育時間進行。
由于水浴較難將溫度控制在穩定的范圍，因此我們每次試驗時應認真觀察水浴箱的溫度，盡量少開啟水浴箱門，嚴格控制水浴的溫度為37±0.5。同時，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達到平衡。細胞
由于試劑盒通常設定的反應溫度為37度，在這個溫度下溫育一定時間，蒸發的水分會很多，對于整個反應體系來講，各種反應物的濃度會不斷地增加，這樣必會導致反應zui后的值升高。因此溫育時應貼上封板膠。
4. 洗板
洗板在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻是決定試驗成敗的關鍵。ELISA就是靠洗板來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的，通過洗板以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗板時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應嚴格按要求洗滌。洗板如不*，有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標記抗體作用而產生干擾。各的洗液是根據各自試劑的條件配制的，因此采用不配套的洗液常會得到不正常的反應結果，包括本底升高，所以不同的洗液不應混用。洗液應按規定的倍數稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的，過多稀釋洗液，會影響洗液的效果，而使反應的本底升高。反之造成假陰性。稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水，電導率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子，這些離子會占用表面活性劑，使試驗本底增高。細胞
