操作方法

1．鐵蛋白的提取

① 配制2%硫酸銨液，并以1Mol/L的NaOH或HCl調(diào)pH值，正好為5.85。取1g鐵蛋白溶于100ml的2%硫酸銨液中。

② 加入20%硫酸鎘，使zui終濃度為5%，混勻，4℃過夜。

③ 1 500g離心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸銨至100ml，混勻，離心，去除不純沉渣。

④ 于上清液中重新加入20%硫酸鎘，重復(fù)步驟⑵，離心，去上清。

⑤ 檢查沉渣，置顯微鏡下檢查，應(yīng)具有典型的黃褐色結(jié)晶，結(jié)晶為六角形，雙一四點(diǎn)結(jié)構(gòu)，如結(jié)晶不典型，應(yīng)繼續(xù)重復(fù)以上步驟。

⑥ 以少量的蒸餾水溶解，再加50%飽和硫酸銨溶液，使之沉淀，離心，去上清。

⑦ 重復(fù)步驟⑹一次。

⑧ 以少量蒸餾水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。

⑨ 100 000r/min離心2h，去除上部無色上清液(約3/4總量)，置4℃過夜。

⑽ 用微孔濾膜(孔徑0.45μ)過濾，使鐵蛋白含量為65mg/ml～75mg/ml，分裝，4℃保存不要凍干保存,以免鐵蛋白結(jié)構(gòu)遭破壞。

2．鐵蛋白－抗體交聯(lián)法

① 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將鐵蛋白稀釋成20mg/ml～25mg/ml。

② 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室溫?cái)嚢?5min，離心去沉淀。

③ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將提純lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG與鐵蛋白－XC液，4℃攪拌48h。

④ 以0.1Mol/L碳酸銨溶液透析過夜，以除去多余的異氰酸鹽，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢復(fù)到生理水平。

⑤ 超速離心  以1.00×105g離心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS懸浮，再次離心，以除去未結(jié)合的IgG。

⑥ 以血清學(xué)及免疫學(xué)方法測定結(jié)合抗體的特異性、免疫活性以及標(biāo)記效應(yīng)，如果操作步驟嚴(yán)格，結(jié)果是滿意的。

3．鐵蛋白－抗體結(jié)合物處理標(biāo)本

① 將標(biāo)本以5%福爾馬林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。

② 用冷的PBS液洗滌，離心。

③ 如是組織塊，則在解剖顯微鏡下切成更小塊，放入試管中，加入鐵蛋白－抗體結(jié)合物置室溫20min，不時(shí)振蕩,

④ 以冷PBS液洗滌三次，離心。

⑤ 沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗滌。

⑥ 再以鋨酸固定，脫水包埋。

也可以先超薄切片，再進(jìn)行鐵蛋白－抗體結(jié)合物染色。操作如下：

① 將培養(yǎng)細(xì)胞以1%福爾馬林PBS液固定(4℃)。

② PBS液洗滌離心。

③ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液懸浮置入膠透析膜袋中，再將袋置于吸水劑粉末上，待牛血清白蛋白成膠狀物時(shí)，將透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。

④ 取出，切成小塊，以PBS液洗滌。

⑤ 置干燥器中以硅膠干燥。

⑥ 包埋、切片、在水上收集切片置于經(jīng)4%牛血清白蛋白PBS液處理的披有膠膜的載網(wǎng)上(牛血清白蛋白的處理在于減少鐵蛋白結(jié)合物非特異性吸附于載網(wǎng)上)。

⑦ 滴一滴鐵蛋白－抗體結(jié)合物于載網(wǎng)上。

⑧ 5min后，浮網(wǎng)于PBS液面,標(biāo)本面向下，以除去多余的結(jié)合物。

⑨涼干后，滴一滴乙酸雙氧鈾或氫氧化鉛以復(fù)染。水洗、晾干、電鏡觀察。

結(jié)果判定

在已知對照樣品成立的前提下，凡是出現(xiàn)黑色的鐵分子顆粒即表示抗原的存在，判定陽性(＋)，否則判為陰性(－)