1.  新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內切片( 也可- 80 ℃保存)，厚度為 5～6 μm。

2.  載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風吹干。抗體

3.  如不馬上染色，可密封后- 20 ℃保存。

4.  染色前用冷丙酮在 4 ℃固定 10-20 分鐘。

5.  PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘，( 必要時應用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)

6.  3% H2 O2滅活內源性過氧化物酶，20 分鐘，避光；

7.  用 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘；

8.  正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤狀態,）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動物血清）處理，37 ℃，15 分鐘。

附：正常血清配制 ( 或按試劑盒規定的濃度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50 μ+5 μl (10%拋灑量) 計算。

9.  滴加*抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加*抗體，37 ℃ 2 小時（也可置于 4 ℃冰箱過夜） 。

10.  PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

11.  滴加生物素化的二抗，37 ℃，40 分鐘。

12.  PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

13.  滴加三抗 （SAB 復合物） ，37 ℃，40 分鐘。

14.  PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

15.  DAB 顯色，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止） 。

附：DAB 的配制① 儲備液(DAB 25 mg/ml)的配制：DAB 250 mg + PBS 10 ml，待*溶解后分裝成 1 ml，100 μl，50 μl ，20 μ l 等，-20 ℃，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20 μl + PBS 1000 μl + 3% H2O2  5 μl

16.  自來水（細水）充分沖洗。

17.  蘇木素復染，室溫，30 秒，自來水沖洗。

18.  自來水沖洗返藍，15 分鐘。

19.  梯度酒精脫水：80%，2 分鐘  95%，2 分鐘  100%，2 次，5 分鐘。

20.  二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘抗體

21.  封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。