在生物醫學和臨床研究實踐中，經常需要檢測兩種不同物質是否在同一樣品中共存或同一種細胞中共存，因此出現了免疫組織化學雙重染色。此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學和免疫熒光細胞化學法結合；同一切片的再度染色法（先對*種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照）；兩種酶標抗體3又重染色（分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標記第二抗體．用間接法分別顯示A和B抗原，如兩種一抗來自同一種屬，常有重疊染色）；不同種屬來源的抗體雙重染色。目前，zui常用的是zui后一種方法。

不同種屬來源的抗體雙重染色，兩種抗體間無交又反應．特異性較高，即使細胞內抗原量很少也能檢測。但是，當兩種抗原存在于同一部位而其中之一濃度較高，占優勢時將妨礙另一種抗原染色，此種情況應分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。在該方法中應用zui多的是把SABC法或SP法的實驗流程重復兩次，其中兩種不同特異性抗體（可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩個組合），與一抗對應的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來。該方法用于石蠟切片時應考慮所選擇的兩個抗體的修復方法應該一致或一個抗體的修復對另一個抗體的染色結果沒有影響。

在選擇一抗時應避免定位在細胞的同一部位（如胞核、胞漿和胞膜）的兩種抗原，如果不可避免，選擇免疫熒光組織細胞化學雙重染色方法，因為兩種不同顏色的熒光重疊后呈現另一種顏色的熒光（如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現黃色熒光），它比SP法的顯色系統更容易區別和辨認陽性結果在進行雙重染色之前，必須對所選擇的一抗分別進行單獨染色預實驗，預實驗條件必須與雙染條件相同，在觀察預實驗結果和抗體定位正確后，再進行雙染實驗。